Présentation
La plateforme utilise la technologie d’édition du génome à l’aide du système CRISPR/Cas dans le but de générer à la demande de la communauté scientifique des clones cellulaires invalidés pour des gènes d’intérêt, et des clones cellulaires inductibles pour l’expression d’un transgène. Selon chaque projet, la plateforme propose une stratégie de vectorisation du système CRISPR-Cas9 ou une transformation par lentivirus, la technique d’évaluation de l’efficacité et fournit une validation rigoureuse des lignées cellulaires fournies.
Les nucléases artificielles CRISPR/Cas9 reconnaissent des séquences spécifiques réparties dans tout le génome et génèrent des cassures de l’ADN. La réparation de l’ADN par NHEJ (non-homologous end joining) est propice aux erreurs qui génèrent des délétions et/ou des insertions de nucléotides pouvant produire des décalages du cadre de lecture provocant ainsi une invalidation de gène (knock-out ou KO). La recombinaison homologue (HDR) permet d’introduire de nouvelles séquences dans le gène ciblé (knock-in ou KI). Ainsi, les nucléases CRISPR/Cas9 permettent de générer à la fois des KO ou des KI.
Les lentivirus sont capables d’infecter toutes les cellules eukaryotes, y compris les cellules en pause réplicative. Ces propriétés et la création de systèmes lentiviraux déficients ne pouvant plus se répliquer procure un moyen efficace simple et sûr de création de lignées cellulaires transformées avec un transgène pouvant être de grande taille (>10kb). L’utilisation du système Gateway à double sélection (positive + négative) permet de cloner l’ADN complémentaire d’un gène dans un vecteur d’expression avec une efficacité proche de 100%.
Expertise
Notre expertise porte sur la stratégie de ciblage adaptée à chaque gène, le design des sgRNAs, l’appréciation du off target, sur la transfection de lignées cellulaires eukaryotes ainsi que sur la validation des clones cellulaires produits (validation de la mutation pour le Crispr/Cas9, et validation d’un clone inductible avec expression basale minimale du transgène pour les clones inductibles transformés par lentivirus).
Service et engagement
Étudier vos besoins et effectuer l’analyse de faisabilité et le développement méthodologique.
Produire des clones cellulaires invalidés et/ou inductibles par la méthode CRISPR/Cas9 ou par transformation lentivirale.
- Ouvert aux établissements publics (prioritaires) et privés
Services
Crispr
- Etude du gène cible et des stratégies possibles
- Stratégie, le type de Cas, les vecteurs et leurs utilisations
- Design in silico des sgRNA ciblant le site génomique d’intérêt
- Appréciation du off target
- Vectorisation de l’outil (plasmides, vecteurs lentiviraux)
- Validation fonctionnelle des sgRNA
- Design et construction du donneur ADN pour modifier à façon le génome et sa détection (pour les knock in)
- Mise au point de nouvelles techniques d’édition de gène (Cas12, etc.)
Lignées inductibles
- Etude du gène cible et choix de l’isoforme à cloner
- clonage du gène cible dans un vecteur d’expression inductible
- production de lentivirus
- transformation lentivirale
- isolation de clones cellulaires
- caractérisation fonctionnelle de clones cellulaire (expression basale et induction du transgène)